BIOFILMS: KNOWING THE ENTITY

BIOFILMS: CONOCER LA ENTIDAD

AUTORES: Elsa Menoita, Vítor Santos, Carlos Testas , Cláudia Gomes, Ana Sofia Santos

Resumo

Dada a complexidade de algumas feridas complexas/crónicas e sua dificuldade de cicatrização, os biofilmes têm sido apontados como entidades que atrasam todo este processo. Para se poder gerir os casos de feridas com biofilmes é indispensável conhecer a sua origem, estrutura e composição, perceber o seu ciclo de vida de modo a se obter o conhecimento necessário para intervir na sua prevenção e controlo. Como tal, foi efectuada uma revisão bibliográfica de literatura relevante e recente, com vista a caracterizar objectivamente esta entidade, que ainda permanece desconhecida para quem cuida de pessoas com feridas.

Palavras chave: Biofilmes, Cicatrização, Ciclo de Vida

ABSTRACT

Due to the complexity of some complex/chronic wounds and their hard to heal status, biofilms have been described as entities that delay this process. In order to manage the cases of wounds with biofilms it is essential to know its origin, structure and composition, understand its life cycle in order to obtain the necessary knowledge to intervene in the prevention and control. As so, a literature review of recent and relevant knowledge was made, in order to objectively characterize this entity, which still remains unknown to caregivers of people with wounds.

Key words: Biofilms, Wound Healing, Life Cycle Stages

1. Introdução

Actualmente, muitas feridas complexas/crónicas, simplesmente estagnam sem razão aparente.  Não respondem ao tratamento com material de penso avançado, que inclui mesmo os mais recentes avanços no campo dos antimicrobianos e controlo das metaloproteinases da matriz. Isto porque algumas destas feridas apresentam  sinais de infecção local evidente, sem resposta ao respectivo tratamento e outras embora sem sinal de infecção evidente ou  tecido inviável, persistem sem cicatrizar mesmo com a utilização de moduladores e inibidores das proteases, moduladores do pH entre outros. Já é consensual a atribuição de deste atraso na cicatrização à presença de biofilme no leito da ferida em alguns casos especificos, um conceito que começa a merecer mais atenção na área de tratamento de feridas. No entanto será que conhecemos suficientemente esta entidade, de modo a podermos intervir eficazmente no seu controlo? Torna-se fundamental conhecer o seu processo de formação, estrutura e ciclo de vida, para melhor podermos traçar um plano de tratamento de feridas, verdadeiramente custo-efectivo, permitindo em última instância uma melhor qualidade de vida para a pessoa com ferida complexa/crónica.

1.1. Biofilmes microbianos: comunidade complexa

Os microrganismos são estruturas simples, que estão presentes nos mais diversos habitats, mas capazes de desenvolverem comportamentos bastante complexos.

Em 1800, Robert Koch formulou os conhecidos postulados de Koch que foram muito úteis para provar que uma bactéria seria o agente causal de uma determinada doença. Estes postulados basearam-se no paradigma uma-doença/uma-bactéria, e requeriam o isolamento numa cultura pura da bactéria supostamente patogénica. Este conceito da etiologia mono-microbiana das doenças infecciosas ajudou a sedimentar a noção de que cada espécie bacteriana se comportaria como uma entidade isolada tanto no homem como na natureza. A microbiologia tradicional caracterizou durante anos as células encontradas em suspensões como planctónicas (Widgerow, 2008). Estas células foram exaustivamente avaliadas, isoladas e identificadas. Algumas das bactérias planctónicas estudadas têm a capacidade de aderir em várias superfícies, formando biofilmes.

O conceito de biofilme tem emergido gradualmente de estudos científicos durante longo período de tempo, porém, nas últimas duas décadas, essa concepção tem avançado consideravelmente.

Inicialmente, as observações de biofilmes foram realizadas por Antonie Van Leuwenhoek que, estudando amostras de dente, no seu microscópio, notou mais fragmentos de células agregadas do que planctónicas. Porém, a primeira publicação detalhada que descreve biofilmes foi descrita por Zobell em 1943, onde o autor iniciou estudos sobre a adesão de bactérias marinhas em cascos de navios e em diferentes tipos de superfície que incluíam vidro, metal e plástico que estavam submersas.

Técnicas de microscopia mais sofisticadas e efectivas foram empregadas por Costerton em 1978, o qual verificou que a maioria dos microrganismos nos ambientes naturais se encontrava fixo a substatos, e não na forma dispersa em suspensão. Aos microrganismos aderidos foi atribuído o nome de biofilme, composto por células microbianas de fisiologia distinta, chamadas sésseis. A partir de então, o conceito de biofilme tem evoluído e várias pesquisas têm sido realizadas em muitas áreas relacionadas com a ecologia microbiana.

 Estima-se que mais de 90% dos microrganismos vivem sob a forma de biofilmes (Costerton et al., 1987) e praticamente não existe nenhuma superfície que não possa ser ou vir a ser colonizada por bactérias (Characklis & Marshall, 1990).

Em suma, os microrganismos apresentam-se nos ambientes aquosos, tanto na forma planctónica com na forma séssil (Costerton et al., 1987; Characklis et al., 1982). Na forma planctónica os microrganismos encontram-se em suspensão e dispersos no meio aquoso, e na forma séssil encontram-se aderidos a superfícies sólidas sob a forma de biofilmes (Phillips et al., 2010).

 1.2. Estrutura e composição do biofilme

O biofilme microbiano é definido como uma associação de células microbianas fixadas às superfícies, bióticas ou abióticas, envolvidas numa complexa matriz extracelular de substâncias poliméricas, juntamente com os nutrientes capturados para a formação da matriz.

Na década de 1980, considerava-se que os biofilmes fossem representados por uma simples estrutura plana, principalmente 2D, com espessura relativamente constante.

 No entanto, um modelo conceptual formulado a partir da investigação de um sistema particular não deve ser generalizado para a totalidade dos sistemas de biofilmes, como aconteceu com o modelo designado water channel model (Costerton et al. 1994). Tal generalização é incorrecta, em especial considerando a evidência de que cada comunidade microbiana é única (Tolker-Nielsen & Molin, 2000).

Depois de várias investigações, foi possível afirmar que existem, no mínimo, três estruturas diferentes de biofilme. A primeira é a tradicional, plana, visão homogénea da estrutura do biofilme. A segunda, denominada de “Modelo do Mosaico Heterogéneo”, e foi descoberta utilizando-se microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC), para examinar amostras crescidas em superfícies internas de sistema de distribuição de água. Desta forma os investigadores observaram mosaicos constituídos por microcolónias de bactérias ligadas umas às outras por uma substância polimérica extracelular e apresentando colunas (Figura nº1).

O terceiro tipo de biofilme representa o modelo na forma de cogumelo ou tulipa, com estrutura porosa e canais capilares de água, por onde ocorre a distribuição de nutrientes e água (Figura nº2).

Os biofilmes são constituídos por microrganismos, material polimérico extracelular e resíduos do ambiente colonizado, aderidos a uma superfície sólida, formando uma estrutura porosa e altamente hidratada, contendo pequenos canais, abertos por entre as microcolónias (Allison, 2003; Sutherland et al., 2001). Os microrganismos representam somente uma parte da massa de biofilme que, frequentemente, é menor que 10%. Os biofilmes possuem uma enorme diversidade de espécies microbianas, em que os microrganismos frequentemente encontrados são microalgas, fungos, protozoários, bactérias e vírus (Characklis et al., 1990), sendo, no entanto, devido à sua maior versatilidade e resistência, as bactérias os microrganismos predominantes. As bactérias, devido às suas características (como tamanhos reduzidos, elevadas taxas de reprodução, grande capacidade de adaptação e de produção de substâncias e estruturas extracelulares que as protegem do meio circundante), são, de entre todos os microrganismos, consideradas como excelentes produtoras de biofilme (Characklis et al., 1990).

Os biofilmes, complexos ecossistemas microbianos, podem ser formados por populações desenvolvidas a partir de uma única, ou de múltiplas espécies (Rhoads et al., 2008).

Os microrganismos têm sistemas de comunicação entre si, um dos quais chama-se quorum sensing (QS). Estudos baseados numa cultura pura de biofilme de P. aeruginosa cultivado em fluxo laminar (Davies et al. 1998) indicam que quorum sensing é possivelmente importante para a formação de estrutura em biofilmes. Quorum sensing é um mecanismo para regulação de certas actividades celulares, dependente da densidade celular (Salmond et al. 1995), ou seja, é um mecanismo intercelular de sinalização, que tanto pode ocorrer em células microbianas da mesma espécie como em interespécies (Rhoads et al., 2008). As bactérias, sintetizam compostos sinalizadores de baixo peso molecular, os autoindutores (AIs), que são excretados no ambiente. Quando se atinge uma quantidade crítica desses compostos, as bactérias detectam a presença de um número suficiente ou quórum de bactérias e respondem por meio da activação ou repressão de certos genes. Em baixas densidades populacionais, há, proporcionalmente, baixas concentrações destes autoindutores e, por esta razão, talvez não haja seu impacto sobre a expressão genética. Entretanto, quando a densidade populacional de microrganismos se eleva, o mesmo acontece com a concentração de AIs no meio, havendo, assim, influência sobre a regulação genica.

Assim, as etapas do ciclo de um biofilme requerem um sistema adequado de comunicação célula-célula (Steinberg, 2011). A sua fundamental importância consiste na distribuição, na ordenação e na sincronização, para a manutenção da relativa homeostase da comunidade microbiana, o que favorece o acesso a nutrientes ou a nichos ambientais mais favoráveis, permite que as bactérias organizem respostas defensivas, além de optimizar a capacidade das bactérias de se diferenciarem em formas mais bem adaptadas a sobreviverem em ambientes hostis.

Verificou-se portanto, que os microrganismos alteram a transcrição genética como resposta aos AIs, variando, desse modo, a produção de exopolissacarídeos, a motilidade, a produção de enzimas, como proteases, lípases e alginases e, também, a produção de compostos bactericidas e/ou bacteriostáticos. Este processo coordenativo influencia a própria sobrevivência do microrganismo em condições desfavoráveis, principalmente no estágio maduro, no qual há limitação na disponibilidade de oxigénio, nutrientes, componentes orgânicos e inorgânicos, e, até mesmo, a restrição quanto ao espaço físico. Por outro lado, os microrganismos podem rapidamente começar a produzir até 800 novas proteínas para formar microcolónias dentro horas (Sauer, et al, 2002 citados por Wolcott & Rhoads, 2008), através do referido mecanismo de quorum sensing (Rhoads et al., 2008).

Para Flemming (1993), a substância polimérica extracelular (“Extracellular Polymeric Substances” – EPS) que envolve todas as células microbianas representa cerca de 70 a 95% da matéria orgânica da massa seca do biofilme, formando glicocálix. Glicocálix é uma camada abundante de material polimérico extracelular produzida pelas células bacterianas, quando aderentes (Cooper, 2010). Para Bakke et al. (1984), a EPS pode variar entre 50 e 90% do total da matéria orgânica dos biofilmes. Rhoads et al. (2008) por sua vez defendem que, geralmente o biofilme é constituido por 80% de EPS e os microorganismos cerca de 20%. A composição química das EPS é muito heterogénea e complexa, no entanto, de um modo geral, são os polissacarídeos que predominam (Wimpenney et al., 1993). A matriz polimérica pode ser constituída por proteínas, substância húmicas, ácidos nucleicos (DNA, RNA), (Jahn & Nielsen, 1995), glicoproteínas, fosfolípidos (Phillips et al., 2010), etc.

Os exopolissacarídeos da EPS são considerados componentes importantes que determinam a estrutura e a integridade funcional do biofilme microbiano. A EPS age como barreira defensiva, protegendo as células para que não sejam arrastadas pelo fluxo de substâncias, auxiliando a célula a resistir a condições de stress múltiplo, tais como a diminuição de nutrientes e água, a presença de biocidas e outros agentes antimicrobianos e condições ambientais.

Em alguns casos, o EPS é capaz de captar catiões, metais e toxinas, conferindo, também, protecção contra radiações UV, alterações de pH, choques osmóticos, etc.

Assim, a matriz polimérica é a responsável pela morfologia, estrutura, coesão, integridade funcional dos biofilmes e a sua composição determina a maioria das propriedades físico-químicas e biológicas dos biofilmes (Flemming & Wingender, 1999).

No que concerne à distribuição da populacional, as células microbianas presentes nas camadas s superficiais externas têm propriedades semelhantes às das células planctónicas com acesso fácil a oxigénio e nutrientes, são metabolicamente activas e não têm dificuldade na eliminação de detritos metabólicos, sendo que as células incorporadas na matriz estão protegidas de agentes stressores, são metabolicamente menos activas e em fase de dormência.

Conforme já referido, um biofilme é considerado uma estrutura muito adsorvente e porosa (possui espaços intersticiais com água), sendo constituído essencialmente por água, pois contém cerca de 80 a 95% de água. A água é a fracção mais significativa da massa total do biofilme, podendo variar entre 70 a 95% da massa total do biofilme (Flemming, 1993). Outros autores, como Christensen e Characklis (1990); Neu (1994) e Azeredo e Oliveira (2000) referem que a razão massa de água/massa de biofilme pode ser até próximo de 99% ou mesmo atingir valores superiores.Os canais aquosos dos biofilmes (Figura nº3) podem ser comparados a um sistema circulatório primitivo, permitindo a troca de nutrientes e metabólitos, assim como a remoção de metabótilos potencialmente tóxicos. Assim, os biofilmes que se encontram em ambientes naturais são de um modo geral heterogéneos, contendo mais do que um microambiente distinto. No mesmo biofilme podem ser encontrados estratos aeróbios e estratos anaeróbios (Characklis & Marshall, 1989; Van Der Wende & Characklis, 1990). Os primeiros situam-se nas zonas mais superficiais do biofilme e os segundos nas mais profundas, junto ao substrato sobre o qual o biofilme se desenvolve. Esta estratificação deve-se à dificuldade de difusão do oxigénio presente na água através do biofilme, conjugado com o facto do oxigénio disponível ser logo consumido pelos microrganismos que compõem as camadas mais superficiais. De referir ainda que a composição dos biofilmes é dependente das condições do meio (como a temperatura, composição do meio, pressão, pH e oxigénio dissolvido) (Flemming, 1991; O’Toole et al., 2000) e não é necessariamente uniforme, podendo até englobar partículas sólidas (argilas, areias, partículas orgânicas) provenientes do meio aquoso onde está imerso (Characklis e Marshall, 1990; Wimpenny et al., 1993), ou fragmentos proteicos, como fibrina, corpos estranhos como parte de certos materiais de penso, no caso de feridas complexas/crónicas.

1.3. Ciclo de vida do biofilme

A acumulação de biofilme em superfícies é um fenómeno natural que resulta de processos físicos, químicos e biológicos que ocorrem simultaneamente. Na Figura nº 4 estão esquematizadas as diferentes etapas de formação de biofilme.

O transporte de células livres do meio líquido para uma superfície sólida, e sua subsequente fixação, é a base de todo o desenvolvimento de um biofilme. Esta fase ocorre em poucos minutos após o transporte e adsorção à superfície de substâncias orgânicas dissolvidas no meio aquoso (Etapa 1 e 2). Os microganismos, denominados colonizadores primários, que se aderem a uma superficie, passam a se desenvolver, originando microcolónias, que sintetizam a EPS (Rhoads et al., 2008), que passam a ser um substrato para

a aderência dos colonizadores secundários. Estes últimos podem se aderir directamente aos primários, ou promoverem a formação de coagregados com outros microrganismos e então se aderirem aos primários. De facto, uma vez formada a primeira camada de microrganismos, a adesão de outros microrganismos é favorecida. O desenvolvimento e reprodução dos primeiros colonizadores podem, também, contribuir para a modificação das propriedades superficiais da superfície do suporte, tornando-a mais adequada para a colonização subsequente dos microrganismos secundários, favorecendo assim a acumulação de biofilme (Charackils et al. 1990).

A velocidade a que ocorre a formação inicial do biofilme depende da concentração de moléculas orgânicas no meio aquoso que contacta com a superfície sólida, da afinidade das moléculas para com o suporte e das condições hidrodinâmicas do meio líquido (Chamberlain, 1992), sendo de capital importância para a adesão das moléculas orgânicas as características da superfície do suporte (carga superficial, energia livre de superfície, rugosidade da superfície) (Marshall & Blainey, 1990; Flemming, 1990). Quando presentes alguns apêndices celulares, como pili, flagelos e fímbrias o processo de aderência e formação do

biofilme está facilitado (Steinberg, 2011).O pili é um componente competitivo muito importante no processo de adesão inicial e colonização da superfície, essencialmente para microrganismos gram-negativos. O pili tipo IV pode-se ligar a uma grande variedade de superfícies sejam elas abióticas, bem como bióticas, onde se tem adesão célula-célula. É de ressaltar que a colonização de superfícies e o deslocamento de microcolónias, onde o pili tipo IV está presente, é um movimento social, ou seja, envolve o contacto célula-célula, orientando-se este por nutrientes e sinalizadores, a que se designa por quimiotaxia. Os flagelos são utilizados para locomoção do microrganismo, e são constituídos por unidades de flagelina e emergem por uma extensão da membrana externa, sendo a sua força motora garantida pela diferença de potencial osmótico de sódio transmembrana e pela degradação de grupos fosfato.

Após ter ocorrido a formação inicial do biofilme, ocorre o transporte de células microbianas desde o meio aquoso até à superfície sólida (Etapa 3).

Esse transporte ocorre devido ao gradiente de concentrações de microrganismos entre o meio aquático e a superfície. As moléculas existentes no desenvolvimento inicial do biofilme podem estabelecer ligações para uma adesão forte e estável através da formação de cadeias poliméricas com os microrganismos existentes à superfície, ou em consequência da motilidade que os microrganismos apresentam devido à existência dos referidos apêndices externos filamentosos, tais como flagelos que permitem a mobilidade, pili, fímbrias que permitem a adesão (Characklis, et al., 1990; Widgerow, 2008).

O processo de dispersão/desprendimento de porções de biomassa de biofilme pode ter origem em fenómenos de erosão superficial, descolamento (“sloughing off”), abrasão e ataque por predadores (Characklis et al., 1990; Gjaltema, 1996) (Etapa 4). A erosão consiste na perda contínua de porções de biofilme causada pelas alterações ambientais. A taxa de remoção do biofilme aumenta à medida que o biofilme se vai desenvolvendo. O descolamento ou “sloughing off” acontece quando há destacamento de grandes porções de biofilme em resultado da alteração de certas condições dentro do próprio biofilme. A abrasão corresponde à perda de biofilme devido a repetidas colisões entre a superfície que suporta o biofilme e as partículas existentes no fluído, ou a colisões de partículas suspensas com biofilme (Gjaltema, 1996). O ataque por predadores (“grazing”) pode também reduzir consideravelmente a acumulação de biofilme (Ratsak et al., 1996). As próprias células englobadas no biofilme podem  provocar o seu desprendimento pela segregação e excreção de enzimas que podem  levar à quebra das ligações da matriz polimérica (Boyd & Chakrabarty, 1994).

Deste modo, de acordo com Bott (1993), a acumulação de biofilme é um processo natural, que ocorre segundo um padrão sigmoidal (Figura nº 6), como resultado de um balanço entre vários processos físicos, químicos e biológicos que ocorrem em simultâneo.

1.4. Considerações Finais

A percepção da forma como as comunidades microbianas co-existem com o seu substrato, como por exemplo o leito de uma ferida, são extremamente importantes, de modo a perceber como abordar este potencial impedimento do processo de cicatrização. Perceber que na sua maioria, os microorganismos vivem em comunidades como biofilmes,

e conhecendo as suas propriedades e modo como se organizam, ajuda na adequação do tratamento e controlo desta entidade.

Por seu lado, também a percepção do biofilme não como uma massa de bactérias e outros microorganismos, mas essencialmente uma massa composta maioritariamente por substância polimérica extracelular, na qual se alojam  e desenvolvem  estas entidades, é factor fundamental na adequação da estratégia de tratamento.

Também fundamental para nortear a nossa intervenção neste tipo de situação, é perceber como é que evoluem estas comunidades ao longo do seu ciclo de vida, de modo a abrir uma nova janela de oportunidade, sob a forma de prevenção do seu crescimento ou reconstituição.

Apesar de ser uma temática relativamente recente na área do tratamento de feridas, os biofilmes já cá estavam antes da humanidade, e estão para continuar. É nosso dever aprender a co-habitar com estes, de modo a podermos assegurar os nossos próprios objectivos pessoais, que neste caso especifico, passa pelo tratamento de feridas, algo também tão antigo como a humanidade.

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